天然植物有效成分的提取新技术——复合生物酶解技术

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酶是生物体活细胞产生的,以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下,将植物细胞壁分解,较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率,改善生产过程中的滤过速度和纯化效果,提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的,应用常规提取设备即可完成,操作简便,成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成,利用酶反应所具有高度专一性的特点,选择相应的酶,将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解,破坏细胞壁结构,使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中,从而达到提取目的,且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质,采用煎煮法时蛋白质遇热凝同,影响提取成分的煎出,如加入蛋白酶,就可以将天然植物中的蛋白质分解析出,如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外,还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等,这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态,并影响提取液的滤过速度,为此要实施除杂,常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法,此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质,有针对性地采用相应的酶,将这些杂质分解或除去,以改善液体产品的澄清度,提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性,决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2.1 用于天然植物细胞破壁的酶 2.1.1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l,4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物,纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝,构成了植物细胞壁的框架,在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅),形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l/3~l/2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用,它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称,包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4~5,最佳作用温度40~60℃。 2.1.2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分,约占植物干重的35%。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶,β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2.1.3果胶酶 果胶质属于黏液质类,是植物细胞的正常产物,多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色,易溶于水;液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃,作用pH值3~6。 2.2用于分离精制、改善提取澄清度的酶 有木瓜蛋门酶、菠萝蛋白酶、葡萄糖苷酶、转糖苷酶。 3应 用 3.1酶法提取 3.1.1含生物碱类成分酶法提取 以黄连提取盐酸小檗碱为例:将黄连粗粉按每g加入10 U量的纤维素酶(活力单位2 000 U·g-1),充分混匀,加3倍量水,用0.3%硫酸调pH值至5后浸泡,在40℃下恒温水浴90 min,将黄连及0.3%硫酸作溶剂置于渗漉筒中,浸渍、渗漉,收集渗漉液,用石灰乳调pH值至10~12,沉淀,抽滤,滤液用浓盐酸调pH值至l~2,加精制食盐使含盐量达7%,充分搅拌,静置24 h,滤过,i)l=淀,在60 ℃下干燥,得盐酸小檗碱粗品。用薄层扫描法进行含量测定,结果表明:黄连经酶法提取后,所得盐酸小檗碱含量为4.2%,而未经酶处理的盐酸小檗碱含量平均为2.5%,两种工艺样品经薄层层析鉴别,提取的成分一致。 3.1.2含黄酮类成分的酶法提取 以葛根提取总黄酬为例:将葛根粉碎成约l cm左右,用3倍水浸泡,加盐酸调pH至4,加0.5%纤维素酶(活力单位约2 000 u·g-1),充分搅拌,置40℃恒温水浴中1.5 h,加5倍95%乙醇回流提取1 h,滤过,得第一次提取液备用;药渣加5倍60%乙醇回流提取0.5 h,滤过,得第二次提取液;两次提取液合并,回收乙醇,离心,取上清液,用正丁醇萃取3次,挥发尽正丁醇,得葛根总黄酮。用紫外分光光度法测定表明,葛根经酶法提取后所得葛根总黄酮含量为8.68%,而未经酶法提取的含量为7.68%。两种T艺样品经薄层层析比较,成分一致。 3.1.3含香豆素成分的酶法提取 以补骨脂提取补骨脂素、异补骨脂素为例:每g补骨脂加入20U纤维素酶,用硫酸调pH值至4.5,充分搅拌,43 cC恒温水浴3 h,放冷至室温后,用0.1 tool·L-1氢氧化钠溶液调pH值至中性,加乙醇使浸泡液的含醇量达50%,体积为补骨脂的10倍,浸泡30 d。用薄层扫描法测定提取液中补骨脂素含量,结果补骨脂经酶法提取的含量0.1814%,而未加酶提取的含量为O.1469%。 3.1.4含多糖类成分的酶法提取 以香菇提取香菇多糖为例:香菇的细胞壁由蛋白质、几丁质和纤维素组成,结构紧密,一般的提取方法因难以破坏其细胞壁,提取效果不理想。采用纤维素酶和菠萝蛋白酶在香菇多糖的提取过程中进行酶解处理,可以大大提高可溶性同形物的提取效果;香菇提取液除去蛋白质后用乙醇沉淀,得到6种多糖的混合物,测定其含量,兀酶处理的含32%,酶法提取的含50%左右。 此外,用纤维素酶处理穿心莲提取穿心莲内酯;用OL--淀粉酶、OL--葡萄糖苷酶、环糊精葡聚糖转移酶处理银杏叶提取黄酮类;用纤维素酶和蛋闩酶处理灵芝提取同形物等已应用于生产中。 3.2酶法分离精制 天然植物在采用常规提取的煎煮过程中,蛋门质遇热凝固体,淀粉糊化,影响有效成分的煎出,并给提取液的分离带来困难。针对水提取液中所含的杂质类型,采用相应的酶(木瓜蛋门酶分解蛋门质、果胶酶分解果胶、淀粉酶分解淀粉),将其降解为小分子物质或分解除去,可改善水提取液的过滤困难问题,提高液体制剂的澄清度和制剂纯度。 以决明子提取总蒽醌、青皮提取陈皮苷为例:决明子中加热水少许,温浸30 min,用10倍水煎煮2 h,再8倍水煎煮1.5 h,滤过,合并两次滤液,浓缩至物料与药液l:5,均分为5份,分别加入复合蛋白酶I(调节到60~70℃)、复合蛋白Ⅱ(55-60 ℃)、果胶酶(55-65℃)、澄清剂(50~60℃)、对照空白,保温2 h,定时搅拌,离心(3 000 rpm),过滤,将上清液和沉淀分别蒸干,结果用复合蛋白酶I处理效果较好,总蒽醌含量0.717%,而空白对照为0.223%。青皮的试验,用果胶酶处理效果较好,陈皮苷含量6.26%,而空白对照为4.47%。 4技术关键 4.1酶的种类 采用酶法处理时,所用酶的种类应根据天然植物中的有效成分,辅助成分及物料的性质来确定,不能一概而论。若采用复合酶,则复合酶的组成、比例也应筛选。关于酶的用量,需在含相同底物的提取液中加入不同量的酶进行酶解。通过测定酶解产物的含量,以确定最适用量。 4.2酶解温度 在其他条件相同的情况下,将酶反应液分成若干份,分别控制在不同的温度下进行酶解反应,测定酶反应的活性。以酶反应活性对温度作图,曲线上酶活性最高点所对应的温度就是该反应的最适温度,此时酶表现出最大的活性。若温度超出该范围,酶活性逐渐降低。 4.3酸碱度 酶反应需在一定pH值条件下进行,不同的天然植物使用酶的种类不同,酶解时的最佳pH值应根据试验来确定。 4.4酶解时间 不同酶的最佳酶解时间需通过试验确定。 4.5酶解工艺 采用酶反应法时,天然植物的粒度、浸泡时间、酶加入时间、搅拌速度等都影响酶解效果,需以目标成分含量、酶的活性、对药效的影响、能否与其他方法联用等指标进行综合优选

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